Rhodamine 123 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit

羅丹明123線粒體膜電位檢測試劑盒

產品信息

產品描述

羅丹明123線粒體膜電位檢測試劑盒（Rhodamine 123 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit）是一種以羅丹明123為熒光探針，快速且靈敏的檢測細胞或純化線粒體膜電位變化的試劑盒。因線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。因此本試劑盒可用于早期的細胞凋亡檢測。

羅丹明123（Rhodamine 123，簡寫：Rh123），一種細胞膜滲透性的陽離子熒光探針，一種線粒體跨膜電位的指示劑。羅丹明123快速穿透細胞膜，僅需幾分鐘就可以被具有活性的線粒體所俘獲，且對細胞沒有任何毒性。激發波長為507nm，發射波長為529nm。熒光顯微鏡下觀察，呈現黃綠色熒光，也可用熒光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測，通過熒光信號的強弱來判斷線粒體膜電位的變化和凋亡或壞死的發生。

羅丹明123檢測線粒體膜電位的原理在于：正常細胞中，羅丹明1223依賴線粒體跨膜電位（ΔΨm）選擇性進入線粒體基質，可發出明亮的黃綠色熒光；當細胞發生凋亡或壞死，線粒體膜電位喪失，線粒體通透性轉化孔持續開放，引起線粒體膜電位的崩潰，羅丹明123從線粒體中釋放出來，從而導致線粒體內黃綠色熒光強度的明顯降低。需注意，有文獻報道在某些特定情況下，羅丹明123在線粒體內過度聚集后可能出現自淬滅現象，線粒體內黃綠色熒光強度降低；而在凋亡發生時，線粒體中黃綠色熒光增強。

產品包裝

保存與運輸方法

保存：-20℃避光保存，1年有效。

運輸：冰袋運輸。

注意事項

1） 羅丹明123染液（1mg/ml）在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內，可以20～25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。

2） 本試劑盒僅適用于活細胞或分離線粒體的檢測，不可用于固定或凍存的細胞或組織樣本的檢測。

3） 熒光酶標儀檢測時須使用適合熒光檢測的黑板或白板。

4） 如實驗需要，可選擇CCCP（MX3258）或FCCP（MX3259）用作陽性對照，誘導線粒體膜電位喪失。

5） 熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

6） 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

需要自備的儀器和試劑

1） 流式細胞儀、熒光光度計、熒光酶標儀、熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡（激發波長：488-505nm，發射波長：515-575nm，一般為529nm）。

2）【可選】線粒體提取試劑及其配套儀器   3）1.5ml微量離心管    4）載玻片   5）無菌雙蒸水

使用方法

1、試劑準備

于正式實驗前，取適量低溫保存的染色緩沖液（5×）用無菌雙蒸水稀釋到1×，待用。（比如：1ml染色緩沖液（5×）加入4ml雙蒸水，混勻即可）。

2、細胞染色及分析

2.1收集培養細胞調整其密度為1×106/ml，重懸于培養基中；

2.2加入羅丹明123染液（1mg/ml） 使其濃度為：0.1 - 50 µg/ml（根椐細胞種類不同而濃度不同，一般染色濃度為3 - 10 µg/ml）；

2.3 37℃孵育1 - 30 min（根椐細胞種類不同而不同，一般染色時間為10 min）；

2.4離心后用培養基洗細胞兩次；

2.5重懸細胞于培養基中，37℃培養60 min；

2.6根據實驗需求，選擇合適的儀器檢測：

① 流式細胞儀檢測：激發波長488-505nm，發射波長515-575 nm（一般為529nm）；

② 熒光顯微鏡觀察：滴加100 µl上述混合液于載玻片上，激發濾片波長488nm，發射波長為529nm觀察。

3、線粒體染色及分析

3.1按照常規方法提取線粒體（或根據商業化的線粒體提取試劑盒來操作），之后用適量的1×染色緩沖液重懸線粒體；

3.2按照常規方法進行蛋白含量測定，之后用1×染色緩沖液調配成3mg/ml蛋白濃度的線粒體溶液；

3.3取2ml 1×染色緩沖液和1ml線粒體溶液；

3.4加入適量待測化合物（同時設置陰性對照組），25℃孵育3min；

3.5加入10µl羅丹明123染液；

3.6用熒光光度計來檢測：將上述混合液全部加入石英比色皿中，置于25℃測定，激發波長488-505nm，發射波長529nm，連續記錄從0-30min內熒光強度的變化。亦可以用熒光酶標儀來檢測，激發波長為507nm，發射波長為529nm；或在軟件中將檢測對象設置為FITC，即可檢測羅丹明123的信號。

4、熒光觀測和結果分析

羅丹明123的激發波長為507nm，發射波長為529nm。如使用熒光顯微鏡觀察，可以參考觀察FITC等其它綠色熒光檢測時的設置。黃綠色熒光變弱，說明線粒體膜電位下降，并且該細胞很可能處于細胞凋亡早期。通過對比實驗組與陰性對照組測量的相對熒光值（Relative fluorescence values, RFU），可得出藥物處理后線粒體內羅丹明123熒光強度的變化。此處的陰性對照組為僅含染色緩沖液未經染色的細胞樣品。

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